Nukleazy bakteryjne i bakteriofagi – czy to klucz do kształtowania flory bakteryjnej?
Projekt pt. „Wtórne metabolity wybranych składników diety jako czynniki zapobiegające nieszczelności nabłonka jelitowego oraz kształtujące mikroflorę jelitową – czy wpływają na bakteriofagi i nukleazy bakteryjne?” pod kierunkiem prof. Moniki Czerwińskiej otrzymał dofinansowanie Narodowego Centrum Nauki w konkursie OPUS 26 [nr grantu UMO-2023/51/B/NZ9/00305].
Wpływ diety na florę bakteryjną i flory bakteryjnej na zdrowie
Zwiększone spożycie owoców i warzyw to jeden z kluczowych elementów walki z chorobami cywilizacyjnymi takimi jak otyłość, cukrzyca, choroby układu krążenia czy choroby nowotworowe. Żywność pochodzenia roślinnego jest bogata w związki polifenolowe. Polifenole, chociaż nie należą do składników odżywczychm są bardzo ważnymi składnikami naszej diety. Szeroko omawiane są ich właściwości antyoksydacyjne i przeciwzapalne. Wiele danych naukowych wskazuje, iż prozdrowotne efekty polifenoli są znacznie szersze. Wpływają one na aktywność enzymów trawiennych, hamowanie apetytu, a także na skład mikroflory jelitowej.
Obecnie nie ulega wątpliwości fakt, że skład flory bakteryjnej istotnie wpływa na stan zdrowia i ryzyko rozwoju licznych chorób. Znaczny wpływ na skład mikroflory jelitowej ma skład naszej codziennej diety czyli nasz sposób żywienia. Zaobserwowano, że nawet krótkotrwałe spożywanie wyłącznie produktów pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego istotnie modyfikuje strukturę i aktywność flory jelitowej. Jej zmiany, zwane dysbiozą, mogą powstać na skutek podawania antybiotyków, infekcji jelitowych, chorób układu trawiennego, a także niskiego spożycia błonnika pokarmowego oraz niewydolności systemu obronnego.
Co kształtuje florę bakteryjną?
Należy podkreślić, iż po pierwsze, flora bakteryjna uczestniczy w rozwoju chorób układu pokarmowego. Po drugie, wszelkie niekorzystne zmiany w organizmie skutkują zmianami w składzie i właściwościach mikroflory.
Koncepcja, zgodnie z którą składniki odżywcze decydują o tym, które organizmy mogą skutecznie kolonizować i przetrwać w jelitach, została po raz pierwszy zaproponowana jako tzw. teoria niszy składników odżywczych Rolfa Fretera. Freter postulował, że organizm może przetrwać tylko wtedy, gdy jest w stanie efektywniej niż jego konkurenci wykorzystać jeden lub kilka ograniczających składników odżywczych.
Obecnie nie kwestionuje się faktu, iż skład naszej diety odpowiada za to, które mikroorganizmy pomyślnie kolonizują i utrzymują się w jelitach. Z drugiej strony wiadomo, że pierwszoplanowymi czynnikami wpływającymi na liczebność populacji bakteryjnych są bakteriofagi. Bakteriofagi, uważane za najliczniejsze jednostki biologiczne, to wirusy bakteryjne obecne w środowisku naturalnym, które infekują i replikują w komórkach bakteryjnych, ale nie atakują komórek ludzkich ani komórek innych ssaków. Mieszanki fagów zostały po raz pierwszy zastosowane w 1919 roku (Félix d’Hérelle) do leczenia chorób bakteryjnych poprzez zabijanie patogennych i oportunistycznych bakterii chorobotwórczych w jelitach, ukazując wiele zalet fagoterapii w porównaniu z antybiotykoterapią.
Wyzwaniem dla modelowania bakterii jest kształtowanie drobnoustrojów w kierunku pożądanych populacji i atakowanie docelowych bakterii poprzez pokonanie ich strategii obronnych. Chociaż już od 1958 roku, kiedy to Joshua Lederberg otrzymał Nagrodę Nobla za odkrycia w zakresie rekombinacji genetycznych u pałeczki okrężnicy (Escherichia coli), rozumiemy mechanizm transdukcji wirusowej u bakterii, to jednak mechanizm kształtowania mikroflory jelitowej nie został wyjaśniony. Ze względu na istotną rolę mikroflory jelitowej konieczne jest wyjaśnienie tego mechanizmu oraz opisanie na poziomie molekularnym działania czynników, które pozwolą na jej utrzymanie prawidłowego składu.
Jak działają bakteriofagi?
Bakteriofagi, poprzez infekcję i replikację w komórkach bakteryjnych, są istotnymi czynnikami determinującymi liczebność populacji bakterii. W dosłownym tłumaczeniu bakteriogfagi są „zjadaczami bakterii”, których celem jest zniszczenie komórki gospodarza. Bakteriofagi wiążą się z receptorami w ścianach zarówno bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, w oparciu o sekwencje peptydowe i reszty polisacharydowe.
W zależności od rodzaju faga i stanu fizjologicznego bakterii cykl życiowy może przebiegać w kierunku litycznym lub lizogennym. Chociaż bakteriofagi nie mogą infekować i replikować się w ludzkich komórkach, stanowią ważną część ludzkiego mikrobiomu i krytyczny mediator wymiany materiału genetycznego między bakteriami chorobotwórczymi i niepatogennymi. Oprócz wymiany genetycznej bakteriofagi mogą regulować i zmieniać populacje drobnoustrojów, ponieważ atakują określone gatunki bakterii, pozostawiając inne.
Modyfikacje genetyczne w obrębie bakterii mogą być kluczowym wyjaśnieniem rozległych zmian zachodzących w mikrobiomie i wpływającym na procesy zachodzące w jelitach.
Nukleazy bakteryjne – czy to nowy punkt uchwytu?
Nukleazy, w tym rybonukleazy (RNazy) i nukleotydazy, należą do esteraz, które stanowią podgrupę hydrolaz. Enzymy hydrolizujące rozcinają wiązania fosfodiestrowe w kwasach nukleinowych i nukleotydach biorących udział w transporcie puryn, które są składnikiem ważnych biomolekuł, takich jak ATP, czyli nośnik energii niezbędnej do przebiegu procesów metabolicznych.
W związku z tym, że metabolity związków naturalnych często kumulują się w przewodzie pokarmowym, zwłaszcza w jelicie grubym, w projekcie finansowanym przez Narodowe Centrum Nauki skupimy się na nukleazach bakteryjnych. Białka te uczestniczą bowiem w procesach replikacji i naprawy kwasów nukleinowych, a zatem można przypuszczać, że są zaangażowane w cykl rozwojowy bakterii.
Badania nad fagami
W związku z dramatycznym wzrostem liczby szczepów bakterii opornych na antybiotyki, badania nad fagami litycznymi cieszą się w ostatnim czasie coraz większym zainteresowaniem. Dostarczają one potencjalnych korzyści i znajdują zastosowanie jako środki przeciwbakteryjne, technologie diagnostyczne czy środki kontroli biologicznej. Biorąc pod uwagę potencjał pojedynczej dawki i brak oporności krzyżowej z antybiotykami, terapia fagowa wykazuje większą przewagę nad leczeniem antybiotykami. Mieszanki fagów, zwane intestifagami, składające się z bakteriofagów litycznych, m. in. dla salmonelli oraz różnych serotypów enteropatogennych Escherichia coli, są stosowane w infekcjach. Znane są produkty, które zawierają bakteriofagi zabijające w jelicie wspomniane bakterie patogenne. Z drugiej strony bakterie wykształciły różne mechanizmy obronne przed fagami, a ich proces powstawania doprowadził do ewolucji genomów tych mikroorganizmów. Pierwszy mechanizm zapobiega przedostawaniu się fagów poprzez blokowanie adsorpcji fagów na powierzchni komórki lub poprzez hamowanie wstrzykiwania wirusowego DNA do komórki.
Do alternatywnych mechanizmów obrony przed fagami należą system odporności adaptacyjnej bakterii zwany CRISPR-Cas, układ toksyna-antytoksyna lub systemy nieudanej infekcji, które wyzwalają odporność nabytą, stan uśpienia, tymczasowe zatrzymanie wzrostu, a nawet śmierć komórki. Nieudane zakażenie jest przykładem procesu zaprogramowanej śmierci komórki, który zapobiega zarówno uwolnieniu funkcjonalnych wirionów, jak i ich rozprzestrzenianiu się na inne komórki bakteryjne w populacji.
W ostatnim czasie zwrócono uwagę na retrony. Dopiero w 2020 r. stwierdzono, że tworzą one funkcjonalny składnik dużej rodziny systemów obrony przeciwfagowej, szeroko rozpowszechnionych u bakterii i zapewniających oporność na szeroką gamę fagów, w której pośredniczy infekcja poronna. Retrony są przykładem elementów genetycznych zawierających odrębne sekwencje DNA, które kodują odwrotną transkryptazę, podobną do tej, którą wytwarzają retrowirusy. Retronowe DNA jest powszechnie kojarzone z DNA profaga i można je znaleźć w genomach wielu różnych bakterii. Koduje ono elementy funkcjonalne odgrywające kluczową rolę w działaniu przeciwwirusowym. Coraz częściej sugeruje się, że elementy retronowe mogą wywierać niewielki, ale potencjalnie znaczący wpływ na komórkę gospodarza bakteryjnego, np. umożliwiać jego kolonizację w jelicie. Retrony kodują trójdzielne układy toksyna-antytoksyna, których elementy warunkują rozwój bakterii, natomiast ich brak lub nieprawidłowe działanie hamuje rozwój bakterii m.in. w niskiej temperaturze lub warunkach beztlenowych. Nieudane zakażenie i insercje retronów do genomów drobnoustrojów zostały najdokładniej zbadane na przykładzie pałeczki okrężnicy. Pomimo dużej różnorodności fagów w mikroflorze jelitowej, ich wpływ na bakterie pozostaje słabo poznany.
Modelowanie składu mikroflory w kierunku pożądanych populacji jest wciąż wyzwaniem, które przypuszczalnie możemy rozwiązać m.in. poprzez poznanie sposobów wpływu na bakteryjne strategie przeciwfagowe.
Wpływ związków pochodzenia naturalnego na fagi i nukleazy bakteryjne kluczem do kształtowania flory bakteryjnej?
W projekcie pt. „Wtórne metabolity wybranych składników diety jako czynniki zapobiegające nieszczelności nabłonka jelitowego oraz kształtujące mikroflorę jelitową – czy wpływają na bakteriofagi i nukleazy bakteryjne?” zajmiemy się kwestią wpływu związków pochodzenia naturalnego na fagi i nukleazy bakteryjne jako potencjalnego mechanizmu kształtowania mikroflory jelitowej.
Wiele danych wskazuje, że nieszczelność bariery jelitowej i zaburzenia mikroflory jelitowej przyczyniają się do rozwoju różnych stanów patologicznych, w tym zespołu jelita drażliwego, zapalenia jelit czy przewlekłej choroby wątroby, a także otyłości i cukrzycy. Wszelkie zmiany w obrębie nabłonka jelitowego otwierają bowiem drogę do nadmiernego przepływu lipopolisacharydów, które są składnikami zewnętrznej osłony bakterii Gram-ujemnych. Dieta wysokotłuszczowa zwiększa udział bakterii jelitowych zawierających LPS. Istnieją dowody na to, że składniki odżywcze mają ogromny wpływ na rozwój prawidłowo funkcjonującej mikroflory, dzięki czemu potencjalnie chronią nabłonek jelitowy przed bakteriami chorobotwórczymi. Dieta bogata w produkty roślinne może znacząco ograniczyć występowanie zespołu nieszczelnego jelita i przewlekłego stanu zapalnego o niskim stopniu nasilenia. Żywność pochodzenia roślinnego jest źródłem związków z klasy flawonoidów i karotenoidów, procyjanidyn, irydoidów i antocyjanów, które po trawieniu w przewodzie pokarmowym dostarczają potencjalnie aktywnych metabolitów. Niektóre z tych substancji charakteryzują się niską biodostępnością, ale przypuszcza się, że mają istotny wpływ na skład mikroflory jelitowej.
Celem zaprojektowanych przez nas badań jest ocena integralności nabłonka jelitowego, przecieku LPS, białek tkanki tłuszczowej i profilu lipidowego u zwierząt karmionych dietą wysokotłuszczową oraz składnikami pochodzenia naturalnego. Określone zostaną zmiany populacji bakterii po zastosowaniu ekstraktów roślinnych, a także ich wpływ na obecność bakteriofagów. Z drugiej strony niemniej istotna będzie ocena potencjalnego hamowania enzymów bakteryjnych z klasy nukleaz.
Określenie roli produktów pochodzenia roślinnego w kształtowaniu mikroflory jelitowej poprzez wpływ na wirusy i nukleazy bakteryjne będzie stanowić nowy kierunek badań w odniesieniu do interakcji dieta-mikrobiom oraz mechanizmu zasiedlania niszy jelitowej. Mamy nadzieję, że w świetle rosnącej oporności na antybiotyki, wyniki projektu zwrócą uwagę na zapomnianą terapię fagową i produkty pochodzenia roślinnego jako przydatne narzędzia regulacji mikroflory jelitowej m.in. po terapii antybiotykowej.